Der Ames-Test: Ein mikrobiologischer Assay zur Detektion mutagener Substanzen

Der Ames-Test ist ein bakterieller Reverse-Mutationsassay, der zur Identifikation potenziell mutagener und damit möglicherweise kanzerogener Substanzen eingesetzt wird. Entwickelt wurde dieser Test von Bruce N. Ames in den 1970er-Jahren als ein schnelles und kosteneffizientes Screening-Verfahren für chemische Verbindungen.

Das CosPaTox Konsortium empfiehlt, bei post-consumer Rezyklaten alle im NIAS-Screening mittels GC/MS nicht identifizierbaren Verbindungen als potentiell genotoxisch zu erachten. Unter Berücksichtigung des TTC Konzepts ergibt sich eine maximal-akzeptable Exposition für den Konsumenten von 0.0025 µg/kgbw/d. Selbst eine geringe Konzentration unidentifizierbarer Substanzen führt somit sehr schnell zur Überschreitung dieses Grenzwerts.

Hier kann die Durchführung eines Ames-MPF-Tests Vorteile bieten, da bei einem negativen Ames-Test kein Anhaltspunkt für DNA-reaktive (bzw. mutagene) Verunreinigungen in hohen Konzentrationen im Migrat gegeben ist und nicht identifizierbare Substanzen deshalb mit Cramer Klasse III (1.5 µg/kgbw/d) bewertet werden können.

Methodologie und Prinzip

Der Test basiert auf der Verwendung histidinauxotropher Stämme von Salmonella typhimurium, die gezielt mutiert wurden und nicht mehr in der Lage sind, die für das Überleben notwendige Aminosäure Histidin zu synthetisieren. Diese Bakterien können in einem histidin-freien Medium nur dann wachsen, wenn eine Reversion der ursprünglichen Mutation durch DNA-reaktive oder mutagene Substanzen erfolgt, die ihre Biosynthesefähigkeit wiederherstellt.

Das zu testende Material wird mit einem Lösungsmittel extrahiert, die Probe aufkonzentriert und zusammen mit einem histidin-freien Indikatormedium und der entsprechenden S. Typhimurium Kultur in Mikrotiterplatten inkubiert. Bei ausgeprägtem Bakterienwachstum, durch ein sehr mutagenes Umfeld, sinkt der pH Wert, was durch einen Farbumschlag im Indikatormedium sichtbar gemacht wird.

• Eine erhöhte Zahl von Revertanten im Vergleich zur Negativkontrolle weist auf eine mutagene Wirkung der Testsubstanz hin.

• Ist die Anzahl der Spontanmutationen vergleichbar mit der Negativkontrolle, gilt die Substanz als nicht mutagen.

• Eine Positivkontrolle mit einer bekannten mutagenen Substanz (z. B. 2-Nitrofluoren oder 2-Aminoanthracen) stellt sicher, dass der Test funktionsfähig und aussagekräftig ist.

Integration metabolischer Aktivierung

Da zahlreiche Substanzen erst nach metabolischer Biotransformation mutagen wirken (z. B. Prokanzerogene), wird häufig ein S9-Metabolismusaktivierungssystem eingesetzt. Dieses besteht aus einem Leberhomogenat (S9-Fraktion), meist von Ratten, das eine Mischung metabolischer Enzyme enthält, insbesondere aus dem Cytochrom-P450-System.

Die Integration dieser metabolischen Aktivierung erlaubt die Detektion von Substanzen, die erst durch enzymatische Umwandlung in mutagene Metabolite überführt werden.

Bewertung und Aussagekraft

Der Ames-Test ist eine empfindliche, reproduzierbare und standardisierte Methode zur Detektion von Basensubstitutionen und Frame-Shift Mutationen. Er wird weltweit als Bestandteil regulatorischer Mutagenitätstests verwendet, unter anderem von der OECD (Test Guideline 471) oder zur Prüfung der Wasserqualität (ISO 11350:2012)  sowie in der pharmazeutischen und chemischen Industrie zur Sicherheitsbewertung neuer Substanzen.

Allerdings weist der Test methodische Limitationen auf:

• Er detektiert nur punktuelle Genmutationen, nicht jedoch Chromosomenaberrationen oder epigenetische Effekte.

• Falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse sind möglich, weshalb manchmal ergänzende In-vitro- und In-vivo-Tests (z. B. der Mikronukleustest oder der Comet-Assay) erforderlich sind.

• Die Übertragbarkeit auf den Menschen ist eingeschränkt, da bakterielle DNA-Reparaturmechanismen und Stoffwechselprozesse sich von denen eukaryontischer Zellen unterscheiden.

• Die Empfindlichkeit bzw. Nachweisgrenze ist schlechter als jene instrumentell-analytischer Verfahren.

Fazit

Grundsätzlich ist der Ames-Test ein essenzielles Instrument in der Mutagenitätsprüfung und ermöglicht eine erste Einschätzung der genotoxischen Potenz chemischer Verbindungen. In der Bewertung von post-consumer Rezyklaten liefert der Ames Test orthogonale Informationen zu einem non-target-Screening mittels GC/MS und ergänzt dadurch die Sicherheitsbewertung dieser Materialien - gerne unterstützen wir Sie bei diesem Vorhaben.